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IS-OGP:提升傳統(tǒng)顯微鏡在光遺傳學(xué)中的應(yīng)用
更新時間:2024-08-23   點(diǎn)擊次數(shù):274次

IS-OGP:提升傳統(tǒng)顯微鏡在光遺傳學(xué)中的應(yīng)用

光遺傳學(xué)是一種利用光來控制活體組織內(nèi)細(xì)胞活動的技術(shù)。這可以是從廣泛照射腦組織以刺激實(shí)驗(yàn)室動物的特定活動,到監(jiān)測單個神經(jīng)元水平的通路。光遺傳學(xué)的一個關(guān)鍵要求是能夠精確地將光定向到實(shí)驗(yàn)對象,主要是在顯微鏡下進(jìn)行。

許多生物過程是基于離子濃度梯度在兩個親水區(qū)域之間,通過脂質(zhì)膜的差異來進(jìn)行的。例如,線粒體中的能量是以質(zhì)子(pH)梯度的形式產(chǎn)生的,肌肉細(xì)胞的收縮是由鈉(Na+)和鈣(Ca2+)離子梯度介導(dǎo)的,而神經(jīng)脈沖的傳遞涉及鈉(Na+)和鉀(K+)離子的流動。


幾十年來,研究人員在所謂的“膜片鉗"研究中使用微小機(jī)電探針研究和操縱這些電位;通常,微管電極插入細(xì)胞或?qū)ν饽ば纬擅芊?。而現(xiàn)在,光遺傳學(xué)領(lǐng)域?yàn)檫@個謎題的另一面帶來了光子解決方案,即操縱這些細(xì)胞間的電位差。

第一個光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)利用了天然存在的、光激活的蛋白質(zhì),稱為視蛋白,用于充當(dāng)特定離子的泵。一旦實(shí)驗(yàn)原理被成功證明,研究會很快擴(kuò)展到一系列的通道視紫紅質(zhì)和其他類別的基因編碼工具(例如,C1V1)。這些光遺傳激活劑為科學(xué)家提供了一種機(jī)制,可以在毫秒內(nèi)使用適當(dāng)波長和強(qiáng)度的光來打開或關(guān)閉目標(biāo)細(xì)胞(例如,肌肉細(xì)胞、大腦皮層神經(jīng)元)。


光遺傳學(xué)在生命科學(xué)研究中具有極其廣泛的應(yīng)用,從觀察孤立細(xì)胞的活動,到刺激實(shí)驗(yàn)室動物的特定行為,再到研究大腦皮層中的神經(jīng)通路。對于宏觀應(yīng)用,照明需求通常相對簡單。在尺寸譜系的另一端,多光子激發(fā)顯微鏡使得在體內(nèi)以單個神經(jīng)元分辨率進(jìn)行三維研究成為可能。在這些JI*端情況之間,許多實(shí)驗(yàn)可以在常規(guī)光學(xué)顯微鏡下最*效地進(jìn)行,只要有一種方法可以準(zhǔn)確地將一個或多個輔助光源(激光、LED或過濾燈)對準(zhǔn)視野中的一個或多個目標(biāo)。為了支持此類工作,新一代的光機(jī)電模塊提供了一種成本效益高的方法,將一個可外部控制的次級光源集成到諸如蔡司(Zeiss)、尼康(Nikon)和奧林巴斯(Olymous)等領(lǐng)*xian制造商的傳統(tǒng)三目顯微鏡中。操作原理很簡單(見圖1):將45°分束器放置在顯微鏡主體(管)的無限空間中。具體來說,二向色、帶通或其他分束器被固定在一個緊湊的滑塊組件中,該滑塊組件在顯微鏡主體和三目鏡頭之間機(jī)械地吻合。一旦將滑塊機(jī)制安裝在顯微鏡中,分光器就可以從顯微鏡的光學(xué)路徑中插入或撤出,甚至可以更換為另一個分光器,而無需任何機(jī)械干擾或拆卸。

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1. 光學(xué)機(jī)械模塊,例如Siskiyou IS-OGP,提供了一種成本效益高的方法,用于將一個可外部控制的次級光源集成到傳統(tǒng)的三目顯微鏡中。一個45°的二向色鏡、帶通或其他分光器被固定在一個緊湊的滑塊組件中,該組件在顯微鏡主體和三目頭之間機(jī)械地嵌合?;瑝K允許分光器無縫插入和從顯微鏡光路中撤出,甚至可以更換為另一個分光器。


從單模光纖耦合的準(zhǔn)直器輸入的準(zhǔn)直光通過一個精密的XY雙撓性支架橫向輸入到組件中(見圖2)。顯微鏡物鏡將結(jié)果光點(diǎn)聚焦在樣本平面上。光點(diǎn)直徑取決于光的波長和物鏡的倍數(shù);使用常規(guī)的20X物鏡,488nm的光通常被聚焦到大約5μm的極限光點(diǎn)直徑。在支架中調(diào)整準(zhǔn)直器可以使得使用20倍物鏡時光點(diǎn)直徑從5μm變化到50μm。

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2.IS-OGPSiskiyou公司的一個模塊化子組件,它將來自輸入單模光纖的光束校準(zhǔn),并通過45°分光器將其引導(dǎo)至直立顯微鏡的視野中的任何位置。產(chǎn)生的光點(diǎn)具有可調(diào)直徑,并且可以通過機(jī)械(差動螺釘)或自動化執(zhí)行器精確定位或掃描。


緊湊型準(zhǔn)直器配置有標(biāo)準(zhǔn)的FC-female輸入插座,因此可以接受通過單模光纖傳輸?shù)娜魏喂庠?。雙撓性jian*端/傾斜安裝裝置提供了簡單調(diào)整聚焦點(diǎn)位置的功能——與基于雙軸平移的替代方法相比,背隙得到最小化。焦平面的微調(diào)靈敏度再次取決于物鏡的功率,但與顯微鏡筒長無關(guān)。當(dāng)使用20X物鏡與本裝置標(biāo)準(zhǔn)配備的微分螺釘時,粗調(diào)的每轉(zhuǎn)大約為110μm,細(xì)調(diào)的每轉(zhuǎn)為9μm。此外,柔性支架接受電機(jī)驅(qū)動器,適合那些希望實(shí)現(xiàn)自動控制的人。


使用由多個子模塊組成的光學(xué)顯微鏡模塊的另一個優(yōu)勢是成本效益的靈活性。例如,分束器滑塊模塊可以單獨(dú)使用,以創(chuàng)建固定的、45°雙向通向顯微鏡無限空間的訪問。這使得可以使用額外的目鏡、相機(jī)或其他成像設(shè)備;例如,帶有偏振或帶通濾光片的設(shè)備。


賓夕法尼亞大學(xué)Mahoney神經(jīng)科學(xué)研究所的 Minghong Ma 教授和 Wenqin Luo 使用這種新的模塊化設(shè)置進(jìn)行他們的一些研究。Ma和Luo的研究小組正在使用光遺傳刺激和貼片鉗感測相結(jié)合的方法,在離體組織中研究嗅覺系統(tǒng)和脊髓中不同細(xì)胞類型是如何通過突觸連接的。他們使用470nm激光刺激表達(dá)ChR2的神經(jīng)元,并使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)監(jiān)測其他“記錄"細(xì)胞中的相應(yīng)活動。


這些研究是在配備IS-OGP光遺傳學(xué)定位器的Olympus正置顯微鏡(型號BX61)下進(jìn)行的。Ma教授解釋說:“這臺多功能顯微鏡是近十年的老設(shè)備,對于多個研究項(xiàng)目來說是一個重要的共享資源。然而,對于光遺傳學(xué)的一個限制是它只有一個輔助光源輸入——一個配置用于熒光照明的后側(cè)端口。我們的工作需要將這個端口專門用于表層熒光目的。ISOGP提供了一種wan美的方法,可以在不干擾或損害顯微鏡的其他功能和能力的情況下,引入一個額外的激光用于光遺傳學(xué)。"


在Ma教授研究中的一個典型實(shí)驗(yàn)里,一個300到500μm厚的組織切片被放置在記錄室中,并使用標(biāo)準(zhǔn)的含氧溶液保持其活力。熒光顯微鏡用于尋找表達(dá)ChR2的神經(jīng)元軸突;然后使用差分干涉對比(DIC)成像來定位ChR2軸突旁的合適細(xì)胞。隨后,使用貼片鉗電極與該細(xì)胞接觸,以便觀察由于使用470納米激光光(通過IS-OGP模塊引入視野)選擇性刺激ChR2軸突而引起的膜電位變化。典型數(shù)據(jù)圖3所示。

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3.嗅球(OB)神經(jīng)元接收來自嗅覺感覺神經(jīng)元的輸入,并表現(xiàn)出光激發(fā)的反應(yīng)。

(a) 一個OB切片顯示了共表達(dá)氣味受體M72ChR2的嗅覺感覺神經(jīng)元的軸突(左),在另一切片下,熒光照明(右,上)和差分干涉對比(右,下)中,OB神經(jīng)元是可見的。

(b) 在電壓鉗制配置下(Vhold = -70 mV)從OB神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞記錄:激光刺激引起大的、向內(nèi)的突觸后電流,表明光敏感的嗅覺感覺神經(jīng)元與這個細(xì)胞形成了突觸。

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產(chǎn)品特點(diǎn)

顯微鏡安裝方便

簡單的光束控制

使用單模連接器光源

專為蔡司Zeiss、尼康Nikon和奧林巴斯Olymous)顯微鏡設(shè)計


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